NADPH- 胞色素C 还原酶NCR 试剂盒说明书

NADPH-  胞色素 C 还原酶 NCR  试剂盒说明书

测定意义

胞色素 P450 酶是一组 要存在于肝脏的同工酶，在外源物质代谢中 有重要作用，尤是药物和毒物的代谢 NCR 作 P450 酶系的重要一员，催化氧化型 P450 还原再生

测定原理

NCR 催化 NADPH 还原氧化型 胞色素 c，还原型 胞色素 c 在 550nm 处有特征吸收峰通过测定 550nm 吸光度的增加速率，来 算 NCR 活性

自备仪器和用品

可见分光光度计、普通离心机，超速离心机、可调式移液枪、1mL玻璃比色皿和蒸馏水。

试剂组成和配制

试剂一：粉剂×1 瓶，4℃保存。临用前加 100mL 蒸馏水充分溶解。

试剂二：液体×1 瓶，4℃保存。

试剂三：粉剂×1 瓶，-20℃保存。临用前配制，加 2.6 mL 蒸馏水充分溶解，4℃保存。

试剂四：粉剂×1 瓶，4℃保存 临用前配制，加 550 µL 蒸馏水充分溶解，4℃保存。

粗酶液提取

1、除去细胞核和线粒体等：称约0.5g组织，加入4℃预冷的1mL试剂一，冰上充分研磨，10 000g4℃离心30min，取上清液，转移到超速离心管中。

2、粗制微粒体：4℃，100 000g，离心60min，弃上清液。

3、除血红蛋白等杂质：向步骤2的沉淀中加1mL试剂一，盖紧后充分振荡溶解，100 000g离心30min，弃上清液。

4、zui终微粒体：向步骤3的沉淀中加试剂二0.5mL，盖紧后充分振荡溶解，4℃保存待测。

NADPH-细胞色素C还原酶测定操作：

1、分光光度计预热30min以上。调节波长到550nm，蒸馏水调零。

2、试剂二在37℃水浴中预热30min以上。

3. 空白管 取 1mL 玻璃比色皿，依次加入 50µL 蒸馏水 900µL 试剂二 50µL 试剂 和 10µL 试剂四，迅速混匀后于 550nm 处测定 2min 内吸光值变化，第 10 s 和第 130 s 吸光值 注意空白管只需做一次 。

4. 测定管 取 1mL 玻璃比色皿，依次加入 50µL 粗酶液 900µL 试剂二 50µL 试剂 和 10µL，试剂四，迅速混匀后于 550nm 处测定 2min 内吸光值变化，第 10 s 和第 130 s 吸光值。

NCR 活性 算

(1).按照蛋白浓度 算:

活性单位 U  定义 37℃中， 毫克蛋白 分钟催化产生 1µmol 还原型 胞色素 C

NCR (U/mg prot)= (△A 测定管-△A 空白管)÷ε÷d×V 反总÷  Cpr×V ÷T

= 0.529×(△A 测定管-△A 空白管)÷Cpr

(2)按照 本质 算:

活性单位 U  定义 37℃中， 克 品 分钟催化产生 1µmol 还原型 胞色素 C

NCR (U/g)= (△A 测定管-△A 空白管)÷ε÷d×V 反总÷  W×V ÷V 总 ÷ T

= 0.265×(△A 测定管-△A 空白管)÷W

ε ：还原型 胞色素 C 摩尔消光系数，19100L/mol/cm=0.0191L/µmol/cm；d：比色皿光 ，

1cm：V反总：反应体系总体，1010uL=0.00101L：Cpr：上清液蛋白质浓度，mg/mL，需要另外测定：V样：加入反应体系中清液体，50uL=0.05mL： V 样总：加入提取液体，0.5mL：W ：本质，g ：T：反应时间，2min。