抗体和其它分子的共价标记

抗体和其它分子的共价标记

     以共价键结合的荧光染料FITC既能标记细胞内总蛋白、又能更广泛地标记各种特异性配体。这些配体是能与不同的细胞结构很强很特异地结合的各种大分子和小分子，如蛋白、多聚核苷酸、脂类以及其他生物分子、被标记的特异性配体能够探测很多种细胞结构和功能的参量。例如：被标记的外源凝集素可检测细胞表面糖；被标记的抗体可检测表面抗原；被标记的多聚阳离子可检测表面电荷，被标记的激素、生长因子、神经递质和病毒等可以检测细胞受体；被标记的大分子、微生物或者塑料微球可检测细胞内吞性；被标记的BrdU单克隆抗体可检测细胞的DNA合成；用荧光素标记的亲和素以及用带有dUTP的生物素衍生物的DNA探针与靶DNA杂交能够检测原位的特殊基因。用这种技术，能够追踪感染的原因、致癌基因、基因缺陷，有助于发展原位杂交的程序和进行染色体分析。总之，利用荧光探针标记各种配体的方法是研究活细胞、死细胞和组织中的抗原、基因和各种生化过程的有力手段。

    对于抗体和其它配体分子共价标记的荧光探针除FITC外，近年来又发展了很多新的荧光探针，他们的一些理化特性和结构式，分别介绍它们的特性。

    FITC是zui常用的荧光共价标记物，它的一些特性已经在总蛋白含量一节中述及。此外，它易溶于水，很容易共价联结在抗体、外源凝集素、抗生物素蛋白、激素、脂类、蛋白类似物以及其他生物分子上，每个被标记分子可标记2—8个荧光素分子。FITC有较高的消光系数和量子产额（在蛋白中为0.5），适用于氩离子激光器的488nm谱线激发。其缺点是所发射的荧光强度与pH有关，当pH低于8时，荧光显著下降。另一个问题是FITC的激发波长处于产生自发荧光的光谱区，所以FITC荧光受到自发荧光的干扰。自发荧光是当受光激发时，末染色的细胞本身组分所发的荧光。FITC荧光主要受细胞内核黄素自发荧光的影响，测量时必须排除。

    另一种常用的共价标记探针是若丹明。若丹明比FITC光稳定性好，在生理条件不对pH变化不敏感，其荧光受细胞的自发荧光干扰较小。问题是不易溶于水，使其偶联配体后荧光的量子产额较FITC低。TRLTC（Teteamethylrho damine isothioc yanate，四甲基异硫氰基若丹明）、XRITC（Rhodamine X isothiocyanate，异硫氰基若丹明 X）和Texas Red（德州红）都是若丹明的衍生物，是常用的共价标记探针。FITC和TRITC是zui早使用的一组双标记配体的荧光探针，前者发绿色荧光，后者发红色荧光。但是由于FITC和TRITC的量子产额不匹配，（FITC远大于TRITC），以及它们之间光谱范围有较多交叉，容易产生能量转移，因此以后又发展了XRITC和Texas Red。当用FITC和XRITC或者FITC和Texas Red作双标记工作时，选用合适的两组激光光源和滤片系统，可使两种信号之间没有多少光谱交叉。但也存在一些问题，例如由于XRITC的疏水特性，使与其偶联的蛋白不易溶解，并且未与蛋白结合的染料也不易被洗掉。Texas Red有钝化抗体的倾向，造成荧光信号较弱，现在多采用Texas Red标记抗生物素蛋白，这种标记物与生物素偶联的抗体有*的亲和力。

     藻胆蛋白是近年来用于免疫荧光分析和标记各类配体的一类新荧光探针。藻胆蛋白（Phycobiliprotein）是在光合蓝藻（氰菌）和红藻中发现的天然荧光色素家族。藻胆蛋白的色素基是后胆色素（Bilins），每个藻胆蛋白分子含有很多后胆色素。利用藻胆蛋白标记的优点是：对不同类型的藻胆蛋白可用不同波长范围的光激发，但发射波长变化不大。由于藻胆蛋白分子具有许多发色团，它的消光系数和量子产额都很高。由于斯托克斯位移大，激发光和发射荧光容易被分开。藻胆蛋白易溶于水，荧光不易猝灭，对pH变化不敏感。此外，用双功能交联剂与抗体偶联，不影响抗体的活性。但是藻胆蛋白的使用也存在些问题，例如由于藻胆蛋白的分子量很大，难于标记小分子以及细胞内的抗原或受体。

在各类藻胆蛋白中，PE（Phycoerythrin，藻红蛋白）的分子量为240K，激发峰为490—560nm，发射峰为575nm；PC（Phycocyanin，藻青蛋白）分子量224K，激发范围为580—620nm，发射峰为640nm；APC（Allophycocyanin，别藻青蛋白），分子量为110K，激发范围为600—650nm，发射峰为680nm,用氩离子激光器的488nm激发藻红蛋白，可得到较强的橙色荧光，所以可用PE和FITC对各种抗体或配体进行双标记。

根据不同的来源，藻红蛋白分为R-PE，S-PE和B-PE；藻青蛋白分为R-PC和C-PC等几种类型。在同样的条件下，若以488nm激发，S-PE溶液是FITC溶液荧光强度的19倍，是R-PE溶液荧光强度的2倍。来源于红藻的藻红蛋白（R-PE）强2倍。同样，来源于某些红藻的藻青蛋白（R-PC）比来源于其他红藻或细菌的藻青蛋白（C-PC）对550nm的光激发效率高。

上述介绍的各种共价标记的荧光探针，根据它们光谱特性的区别，选择性地使用激发光源和滤片系统，能够对细胞进行多参量分析。氩离子激光器的488nm线和汞灯的485nm线用于激发荧光素、藻红蛋白和碘化丙啶。氪离子激光器的568nm用于激发德州红、染料激光器的600nm用于激发德州红和别藻青蛋白。