荧光测量

荧光测量

   荧光信号是由对细胞进行染色的特异性荧光染料受激后发射的。荧光波长与激发光波长不同且强度较弱，为此就要使用滤片以滤除非荧光信号并使用灵敏的探测器。下面我们将分别进行讨论。

光源

   常用的光源有弧光灯和激光。弧光灯的结构简单、价格便宜、维修容易，但在单一谱线上的功率较弱。激光单色性好、功率强大、不易散焦，但结构复杂、价格昂贵、维修困难。至于选择某种光源的某条谱线做为激发光源，主要是依据被激发的物质，例如细胞的自身荧光物质或荧光染料的激发光谱而定。光源的谱线愈接近被激发物质的激发光谱的峰值，所产生的荧光信号愈强。

1、汞灯 弧光灯中zui常用的是汞灯，汞灯中又以100W汞灯zui常用。汞灯的发射谱线有一个微弱的背景，其谱线大部分在300—450nm，550nm附近也有，由于在300nm波长的紫外范围有一系列谱线，所以要求用紫外激发的场合使用汞灯很是方便。汞灯启动容易，启动后数分钟就可以达到全功率输出，但当熄灭后需待*冷却才可重新启动。某些较新型号的汞灯里面有第三个启动电极，可以热启动。

汞灯点火后内部压力可达40大气压，所以外部必须有可靠的屏蔽，未冷却下来的汞灯不可折卸，调换汞灯时要十分当心。汞灯的缺点之一是44nm—540nm间无可以利用的谱线，这妨碍了某些荧光染料的使用。

2、激光  激光与普通光线不同；激光是受激辐射，普通光线是自发辐射。激光基本是沿着直线传播，发散角很小，通常在10-6球面度量级的立体角内，必要时很容易聚焦到与细胞同一数量级。激光的亮度高，即在单位面积、单位立体角内输出功率特别大。激光还具有良好的单色性，这些特点都是汞灯所不具备的。

    流式细胞术中使用的多为氩离子激光器，亦有用氪离子激光器或染料激光器以获得不同的谱线者。氩离子激光器是一种气体激光器，其频率稳定性高、相干性好，寿命长。它是通过气体放电使氩离子电离并激发，实现粒子数反转而产生激光，谱线有十余条，其中绿光514nm和蓝光488两条谱线增强，几乎占总输出功率的80%。由于这种激光在气体放电过程中要氏氩原子一次电离必须供给相当大的能量，所以要求有几百伏和每平方毫米几个安培的稳定电源。

     激光器的结构，放电管由内径3mm氧化铍毛细管做成，内充0.7mm汞柱的氩气同时架上0.1特斯拉的轴向磁场。此磁场的作用是对带电粒子起约束作用，结果提高了放电区中心的电子密度和离子密度，从而提高了输出功率。色散棱镜用来选择激光波长，使得除某一特定波长之外其他波长的损耗都非常大，只要调整反射镜的角度就你能调诺到所需求的波长。如果用平面镜代替色散棱镜，激光器的输出功率够到散热速度的限制，又由于腔内放电功率很大，约为5000w/cm3，相应的温度为3000—5000度K，所以放电管要通循环以加强冷却，并用导热率高的氧化铍毛吸管以提高，输出功率，现代有些150mW或功率更低的，可用强制风冷，寿命可达5000小时。

    氪离子激光器与氩离子激光器类似，但谱线集中在可见光长波部分，以647nm较强，但噪声较大。染料激光器是将有机染料溶液为另一激光器泵浦发出长波长的激光，例如用氩离子激光器514nm激光泵谱含有Rhodamine  6G水溶液的染料激光器，则后者可输出从550nm到650nm连续可变的激光，在590nm处转换效率可高达50%。免疫学上使用的一些染料，其激光光波长在550nm以上，这时就可用染料激光器。