HPLC的分类

                      HPLC的分类

HPLC可以分为很多类别，按分离机制可分五种主要类型

1. 液固吸附色谱

以吸附剂为固定相，以不同极性的溶剂为流动相，根据试样中各组分吸附能力的不同而进行分离的方法，称液相吸附色谱。在HPLC中常用全多空型硅胶微粒为吸附剂，直径5-10um，由于颗粒小且多空，故柱效很高。

1. 液-液分配色谱

流动相与固定相均为液体的色谱法，称液-液分配色谱法或简称液-液色谱法，按照固定相和流动相极性的差别，可分为正相和反相色谱法两类。

1. 正相液液色谱法 流动相极性小于固定相的液-液色谱法称正相液-液色谱法。洗脱时，极性小的组分先流出色谱柱，极性打的组分在固定相中溶解度大，后流出色谱柱。

原始的正相色谱以含水硅胶为固定相，以乙烷经等为流动相，由于固定液易流失，已被化学键合色谱法取代，化学键合相是将固定液化学键键合在载体表面形成的固定相。正相色谱常用的氰基键合相，性质与硅胶的性质差异较大，常用语糖类的分析。

正相色谱以邮寄溶剂为流动相，使用成本较高。

1. 反相液-液色谱法 流动相极性大于固定相的液-液色谱法称反相液-液色谱法，洗脱时样品中急性大的组分县流出色谱柱。为了防止固定液的流失，反相色谱法均使用化学键合相，典型的反相化学键合相，用多孔载体上化学键合的十八烷基为固定相，流动相常用甲醇-水和乙腈-水。非典型反相色谱系统，由弱极性或中等极性的键合相和极性大于固定相的流动相构成。

反相键合色谱法固定相不流失，流动相以水为主，用甲醇或乙腈调节极性，应用范围很宽，且使用成本低，用HPLC中应用zui广。

一般的反相色谱法，主要用于分离分析非极性和中等极性的化合物，但用两种改进的方法，亦可分离离子化合物。其一为离子对色谱法，在流动相中加入样品离子的反粒子，使其与样品离子构成不荷电的中性离子对，增加其在非极性固定相中的溶解度，使分配系数增加，改善分离效果。分析碱类时可在流动相中加入烷基磺酸盐(PIC），分析酸类则加入四丁基胺磷酸盐(TBA)等。这种方法可以使C18柱子一柱多用，用其取代离子交换法，可避免离子交换法流动相对泵和流路的腐蚀，缺点是PIC试剂较贵，其二为离子抑制色谱法，通过调节流动相的PH，抑制样品则分的解离，增加其在固定相中的溶解度。在流动相中加入醋酸等弱酸，氨水等弱碱，磷酸盐及醋酸盐等缓冲盐调节ph即可用于分离有机酸和有机碱。这种方法比离子对法成本低，但重复性差，且要注意，流动相PH应在2-8之间，超出此范围可能使键合基团脱落、试验后要及时用不含缓冲盐的流动相冲洗，以防腐蚀仪器流路系统。

1. 离子交换色谱

由于聚苯乙烯树脂类具膨胀性，不耐压，HPLC的离子交换剂多用薄壳形或多孔微粒硅胶为载体，表面化学键合各种离子交换基团，常用的为强酸性磺酸基和强碱型季铵盐。一种全多空硅胶为基体的离子交换剂柱效高，载样量大，有较好的耐压性和理化稳定性，但在PH＞9的流动相中硅胶易溶解，未键合的残留硅纯基易生成硅酸盐，故只能在PH0-8使用，层析过程中要控制流动相的PH的离子强度

1. 空间排斥（凝胶）色谱

葡聚糖等软质凝胶在压强0.1Mpa左右即被压坏，不宜在HPLC使用。由苯乙烯和二乙烯交联而成的半硬质凝胶注销较高，常用有机溶剂为流动相，缺点是具膨胀性，流动相流经时柱的填充状态会发生变化。以多空硅胶及多孔玻璃珠等无机材料制成的硬质凝胶，在溶剂中不变形，但装柱时易碎，柱效较差，吸附性较强，有时易拖尾、

5亲和色谱

常用的基质有高度交联的Sephadex和Bio-geldeng 琼脂糖凝胶，大孔径聚丙烯酰胺凝胶和多孔硅胶，配基选择及交换剂合成的原理类似经典亲和层析，目前已有许多商品化的亲合色谱固定相和色谱柱可供选择。

此外，还有手性固定相HPLC，在生物化学中使用不多，故不再介绍。