溶菌酶活力、蛋白浓度测定

    棕红色的燃料考马斯亮蓝G-250 与蛋白质结合后，形成蓝色复合物，zui大吸光度由465nm变为595nm。在一定蛋白浓度范围内，蛋白和燃料的结合符合比尔定律（Beer`s Law）。通过测定595nm处的光吸收值的增加量，可对蛋白质浓度进行定量测定。

溶菌酶是一种N-乙酰细胞壁质聚糖水解酶，该酶可以催化水解细菌细胞壁N-乙酰胞壁酸和N-乙酰胺基葡萄糖之间的β-1,4糖苷键，使细胞壁不溶性多糖分解成可溶性糖肽，从而使细菌溶解。

本实验以融壁微球菌（M,lysodeikticus)为底物，通过测定细菌悬液浊度的变化（OD)来测定溶菌酶的活性。

所需仪器：

仪器：

721分光光度计

材料及试剂

1、溶菌酶

2、磷酸氢二钠（Na2HPO4).

3、磷酸二氢钠（NaH2PO4)

4、融壁微球菌（M.lysodeikticus)干粉。

5、氯化钠（NaCl)。

6、考马斯亮蓝G-250.

7、95%乙醇。

8、85%磷酸。

9、牛血清蛋白(BSA).

实验步骤

一、试剂配制

1、测活缓冲液；含30mmol/L，NaCl的0.1mol/L磷酸盐缓冲液，ph6.2、

2、底物溶液；40mg M,lysodeikticus干粉，溶于100mL测活缓冲液中。

3、考马斯亮蓝G-250试剂；考马斯亮蓝G-250 100mg溶于50mL95%乙醇中，加入100ml85%磷酸 ，用蒸馏水稀释至1000mL,滤纸过滤。（或考马斯亮蓝G-250 100mg 溶于50mL 95%乙醇中，加入100mL 85%磷酸混匀，配成原液。林用钱取原液15mL,加蒸馏水稀释至100mL 滤纸过滤。

4、标准蛋白质溶液；用含0.1mol/L NaCl的0.1mol/L磷酸盐缓冲液，PH7.0（缓冲液A)配制1mg/mL 牛血清蛋白溶液。

蛋白浓度的测定

标准曲线的测定；

取14支试管，按表3.6-1分两组进行平行操作。

绘制标准曲线：以A为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。

测定位置样品蛋白浓度

测定方法同上。取合适的位置样品体积，使其测定值在标准曲线的直线范围内。根据所测定的的A值，在标准曲线上查出相当于标准蛋白的量，从而计算出位置样品的蛋白质浓度。

酶活力的测定；

在室温下，取2个试管，分别在1号管中加入3.0mL测活缓冲液，2.5mL底物溶液；2号管中加入2.5mL测活缓冲液，2.5mL酶液。以2号管为对照，根据不同反应时间在721分光光度计上每个30s测定1号650nm处的光吸收值。按照系列表格记录实验结果。

实验数据处理：标准品

    酶活力单位（U);酶在温室PH6.2条件西，OD每分钟降低0.001为1个活力单位U。根据测得结果，计算出各步数据填入表3.6-3