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Technical articles
更新时间：2024-12-03
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主要用途
细胞胱硫醚-β-合成酶（Cystathionine-β-synthase；CBS）活性酶连续循环光度法定量检测试剂是一种旨在使用胱硫醚-β-合成酶、赖氨酸脱羧酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和苹果酸脱氢酶连续循环法反应系统中，伴随的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的氧化反应， 即采用光度法测定其氧化后峰值（NADH浓度）的变化，以此进行测算单位酶活性的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适合于各种动物和人体细胞裂解悬液等胱硫醚-β-合成酶的活性检测。产品不含污染性蛋白酶，严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，反应优化，检测敏感。
保存方式
保存清理液（Reagent A）在4℃冰箱里，其余的保存在－20℃冰箱里，避免反复冻融；底物液（Reagent F），避免光照，有效保证6月
用户自备
15毫升锥形离心管：用于样品制备的容器
1.5毫升离心管：用于样品制备和保存的容器
细胞刮脱棒：用于细胞脱离
（微型）台式离心机：用于样品制备
培养箱：用于反应孵育
200微升1厘米光径比色皿或96孔板：用于光度分析的容器
分光光度仪或酶标仪：用于光度分析
实验步骤
实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的试剂溶液置入冰槽里融化；底物液（Reagent F）注意避光；缓冲液（Reagent C）室温下预热。然后进行下列操作。
一、 样品准备
1． 准备好75cm2细胞培养瓶或100mm细胞培养皿的待测培养细胞（1至5 X 107细胞）
2． 小心加入3毫升清理液（Reagent A），覆盖生长表面
3． 小心抽去清理液
4． 使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞（注意：可以使用胰酶消化）
5． 加入3毫升清理液（Reagent A），混匀细胞
6． 移入到预冷的15毫升锥形离心管（注意：悬浮细胞从这一步骤开始）
7． 放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为300g
8． 小心抽去上清液
9． 加入100至500微升裂解液（Reagent B），充分混匀
10． 转移到预冷的1.5毫升离心管
11． 强力涡旋震荡15秒
12． 置于冰槽里孵育30分钟
13． 放进4℃微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
14． 小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管
15． 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－GMS30030.1）
16． 即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作
二、测定准备
1． 准备好上述待测样品，置于冰槽里
2． 设定好分光光度仪（温度为37℃）：波长为340nm，间隔2分钟，读数6次（共10分钟），并置零
3． 缓冲液（Reagent C）室温下均衡温度
三、 背景对照测定
1． 移取140微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
2． 加入10微升酶促液（Reagent D）
3． 加入20微升反应液（Reagent E）
4． 加入20微升底物液（Reagent F）
5． 放进37℃培养箱里静置3分钟
6． 加入10微升阴性液（Reagent G）
7． 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
8． 即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照：340波长读数0分钟 －340波长读数10分钟
四、 样品活性测定
1． 移取150微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
2． 加入10微升酶促液（Reagent D）
3． 加入20微升反应液（Reagent E）
4． 加入20微升底物液（Reagent F）
5． 放进37℃培养箱里静置3分钟
6． 加入10微升待测样品（注意：100微克总蛋白；样品须溶解）
7． 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
8． 即刻放进分光光度仪检测，此为样品活性读数：340波长读数0分钟 －340波长读数10分钟
五、 计算样品活性
[（样品读数－背景读数）X 0.2 （体系容量；毫升）X样品稀释倍数]÷[0.01（样品容量；毫升）X 6.22（毫摩尔吸光系数）X 10（反应时间；分钟）]＝单位/毫升
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