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Technical articles
更新时间：2024-10-21
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主要用途
组织CDK2/CYCLIN A激酶活性光度法定量检测试剂是一种旨在通过多肽底物，在CDK2/CYCLIN E抑制剂的存在下，受到CDK2/CYCLIN A磷酸化后，进而由丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶连续循环法反应系统，测定产生ADP过程中，伴随的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的氧化反应， 即采用光度法测定其氧化后峰值的变化，以分析组织裂解样品中CDK2/CYCLIN A特异活性的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种组织裂解萃取液样品（动物、人体）、部分或纯化酶样品中CDK2/CYCLIN A激酶的特异活性定量检测，以及抑制剂和激活剂的筛选。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，高度敏感。
保存方式
保存清理液（Reagent A）在4℃冰箱里；其余的保存在－20℃冰箱里，严格避免光照和反复冻融；有效保证6月
用户自备
CDK2/CYCLIN A激酶：用于抑制剂筛选
1.5毫升离心管：用于样品保存的容器
15毫升锥形离心管：用于样品处理的容器
（微型）台式离心机：用于细胞预处理
200微升1厘米光径比色皿或96孔板：用于光度分析操作的容器
分光光度仪或酶标仪：用于样品光度分析
实验步骤
一、 待测样品准备
1． 手术取出动物组织，并秤重100至500毫克组织重量
2． （选择步骤）放进预冷的15毫升锥形离心管
3． （选择步骤）加入xx毫升清理液（Reagent A）清洗
4． （选择步骤）抽去清理液
5． 移入到一个液氮冻存管
6． 即刻放进液氮罐过夜
7． 次日从液氮罐里取出，即刻（最快速度）用研磨棒碾碎组织成粉末状（注意：切莫使组织冻融）
8． 放进一个1.5毫升离心管
9． 加入置于冰槽里的xx至xx微升裂解液（Reagent B）
10． 强力涡旋震荡30秒，充分混匀
11． 放进冰槽里孵育30分钟，期间每10分钟强力涡旋震荡30秒（注意：如需暂时停止，放进－70℃冰箱里储存备用）
12． 即刻放进4℃微型台式离心机离心10分钟，速度为10000g
13． 小心移取上清液到新的无菌的1.5毫升离心管
14． 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－GMS30030.1）
15． 放进－70℃的冰箱里保存或置于冰槽里备用
二、 测定准备
1． 准备好待测样品（例如组织裂解悬液等），置于冰槽里
2． 设定好分光光度仪（温度为30℃）：波长为340nm，间隔1分钟，读数6次（共5分钟）或0分钟和5分钟各测读一次，并置零
3． 缓冲液（Reagent C）室温下均衡温度
三、 背景对照测定
1． 移取xx微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
2． 加入xx微升酶促液（Reagent D）
3． 加入xx微升反应液（Reagent E）
4． 加入xx微升底物液（Reagent F）
5． 放进30℃培养箱里静置3分钟
6． 加入xx微升阴性液（Reagent G）
7． 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
8． 即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照：340波长读数0分钟 －340波长读数5分钟
四、 样品测定
1． 移取xx微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
2． 加入xx微升酶促液（Reagent D）
3． 加入xx微升反应液（Reagent E）
4． 加入xx微升底物液（Reagent F）
5． 放进30℃培养箱里静置3分钟
6． 加入10微升待测样品（注意：50微克组织裂解蛋白；样品须溶解）
7. 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
8.即刻放进分光光度仪检测，此为样品总活性读数：340波长读数0分钟 －340波长读数5分钟。
五、 酶标仪测定
1． 在96孔板上做好相应标记：背景对照和样品
2． 分别移取xx微升缓冲液（Reagent C）到96孔板里
3． 分别加入xx微升酶促液（Reagent D）
4． 分别加入xx微升反应液（Reagent E）
5． 分别加入xx微升底物液（Reagent F）
6． 轻轻摇动96孔板
7． 在30℃温度下孵育3分钟
8． 分别加入xx微升阴性液（Reagent G）或待测样品（50微克组织裂解悬液蛋白）到相应孔里（注意：样品须清澈）
9． 轻轻摇动96孔板
10． 即刻放进酶标仪检测：0分钟读数和5分钟读数
11． 活性计算：
六、抑制剂筛选
1． 在96孔板上做好相应标记：背景、活性和待测抑制剂样品
2． 按下表加入试剂，进行样品预处理
内容物 | 空背景对照 | 样本背景 | 酶活性 | 待测抑制剂酶活性 |
缓冲液（Reagent C） | xx微升 | xx微升 | xx微升 | xx微升 |
阴性液（Reagent G） | xx微升 | xx微升 | xx微升 | —— |
待测抑制剂 | —— | xx微升 | ―― | xx微升 |
用户自备的纯化酶 | —— | —— | xx微升（1毫单位） | xx微升（1毫单位） |
96孔板每孔总量 | 空背景对照孔 （40微升） | 样本背景孔 （40微升） | 活性孔 （40微升） | 待测抑制剂样品孔 （40微升） |
轻轻摇动96孔板，混匀，放进30℃培养箱里孵育30分钟。然后进行下列操作 | ||||
3 3.3.3.3.分别移取xx微升缓冲液（Reagent C）到新的96孔板的所有孔里
4． 分别加入xx微升酶促液（Reagent D）
5． 分别加入xx微升反应液（Reagent E）
6． 分别加入xx微升底物液（Reagent F）
7． 轻轻摇动96孔板
8． 在30℃温度下孵育3分钟
9． 加入40微升上述预处理的待测样品
10 即刻放进30℃酶标仪检测：测读0分钟和30分钟
11 实际读数：0分钟读数—30分钟读数
12 抑制活性计算：
当前位置：
