酵母细胞β-半乳糖苷酶高质敏感比色法检测试剂盒说明书（中文版）说明书

主要用途

真菌/细胞β-半乳糖苷酶活性高质敏感比色法定量检测试剂是一种旨在使用化学和物理方法，快速有效地裂解真菌细胞，通过高速离心，获得澄清细胞裂解悬液，在β-半乳糖苷酶反应体系里，以氯苯胺红 -β-D- 吡喃半乳糖苷为棕黄色底物，水解所产生的暗红色的氯苯胺红，即采用比色法定量测定细胞裂解悬液制备样品中的β-半乳糖苷酶活性，藉此建立一种简单的定量评价报告基因的而经典的技术方法。该技术由大师级科学家精心研制、成功实验证明的。广泛应用于基因组学、蛋白质组学和其它分子生物学研究。其适用于转基因后的真菌/酵母活体细胞分析。产品即到即用，性能稳定，参数优化，操作简便、比色敏感，堪称国际上同类产品*佳。

产品内容

裂解液（Reagent A）      10毫升

强化液（Reagent B）     2毫升

活性液（Reagent C）   250微升

稀释液（Reagent D）    10毫升

反应液（Reagent E）     2毫升

终止液（Reagent F）    10毫升

产品说明书     1份

保存方式

保存裂解液（Reagent A）、活性液（Reagent C）和反应液（Reagent E）在－20℃冰箱里，避免反复冻融；其余的保存在4℃冰箱里；反应液（Reagent E）避免光照；有效保证6月

用户自备

15毫升锥形离心管：用于真菌/酵母细胞收集的容器

1.5毫升离心管：用于真菌/酵母细胞裂解操作或染色的容器

台式离心机：用于沉淀真菌/酵母细胞

微型台式离心机：用于真菌/酵母细胞裂解悬液澄清

比色皿或96孔板：用于染色后比色检测的容器

恒温水槽或培养箱：用于反应物孵育

计时器：用于反应计时

分光光度仪或酶标仪：用于测定反应物的吸光值

实验步骤

实验开始前，开启分光光度仪预热，设置波长420nm；开启恒温水槽，设置温度为28℃。同时从－20℃冰箱里取出裂解液（Reagent A）、活性液（Reagent C）和反应液（Reagent E）置于冰槽里融化；反应液（Reagent E）避免光照。然后进行下列操作：

一、 样品准备

1． 准备好10毫升待测的新鲜真菌/酵母细胞（OD600＝0.4至0.8，即1至2 X 10⁷细胞/毫升）

2． 移入到预冷的15毫升锥形离心管

3． 置于冰槽里5分钟

4． 放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为1000g

5． 小心抽去上清液

6． 加入250微升裂解液（Reagent A），充分混匀

7． 转移到预冷的1.5毫升离心管

8． 加入100微升强化液（Reagent B）

9． 加入12.5微升活性液（Reagent C）

10． 强力涡旋震荡15秒

11． 置于冰槽里1分钟

12． 重复实验步骤10至11五次

13． 加入250微升裂解液（Reagent A），充分混匀

14． 放进4℃微型台式离心机离心15分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）

15． 小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管

16． 即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作

二、 活性检测

方法一：常规检测（比色皿）

1． 移取100微升上述制备的细胞裂解悬液样品到新的比色皿

2． 加入500微升稀释液（Reagent D）

3． 上下倾倒数次，混匀

4． 放进37℃恒温水槽孵育5分钟

5． 加入100微升反应液（Reagent E）（注意：使用前，充分混匀反应液（Reagent E）中可能的沉淀） 

6． 上下倾倒数次，混匀

7． 放进37℃恒温水槽孵育至少30分钟，直至出现暗红色（注意：参见注意事项11和12）

8． 加入300微升终止液（Reagent F）

9． 即刻放入分光光度仪检测，记录样品吸光读数，理想读数为0.1至1.2范围内

一、 计算样品活性

计算一：按照操作步骤规定

1． 比色皿计算：

[样品读数 X 1.0（反应体积，毫升）]÷[0.1（样品容量，毫升）X 5.5（毫摩尔吸光系数）X 反应时间（分钟）]＝微摩尔CPRG/分钟/毫升

2．96孔板计算：

  [样品读数 X 0.25（反应体积，毫升）]÷[0.02（样品容量，毫升）X 5.5（毫摩尔吸光系数）X 0.5（厘米）X反应时间（分钟）]＝微摩尔CPRG/分钟/毫升

计算二：基本公式

[样品读数X样品稀释倍数 X反应体积（毫升）]÷[样品容量（毫升）X 5.5（毫摩尔吸光系数）X 比色距径（厘米）X反应时间（分钟）]＝微摩尔CPRG/分钟/毫升

计算三：（微摩尔CPRG/分钟/毫升）换算成（微摩尔CPRG/分钟/毫克样品蛋白）

[实际活性值（微摩尔CPRG/分钟/毫升）]÷实际样品蛋白浓度（毫克/毫升）＝微摩尔CPRG/分钟/毫克样品蛋白

注意事项

1． 本产品为20次（比色皿）和80次（96孔板）操作

2． 建议使用核内表达的载体代替胞内表达的载体转染或感染细胞

3． 本产品的各项参数达到化

4． 建议操作时，注意避光

5． 操作时，须戴手套

6． 强化液（Reagent B）为固体状，移取方法为：使用1毫升枪头，将部分剪去；或使用0.5毫升PCR管的盖子内圈盛满；或秤重0.1克

7． 反应液（Reagent E）避免光照和反复冻融

8． 用户可以测定细胞裂解悬液的蛋白浓度，便于计算活性单位之需；建议使用－Bradford蛋白质浓度定量检测试剂盒（GMS30030.1）

9． 如果用户需要测定背景空对照，可以按照活性检测的操作步骤进行，变化在于100微升样品改成100微升裂解液（Reagent A）替代

10． 如果用户测得背景空对照，计算活性时，勿忘（样品吸光读数－背景空对照读数）

11． 反应孵育时间的理想范围为10分钟至30分钟内出现暗红色显色：低于5分钟表明酶活性过高，建议稀释样品，否则影响检测精度 

12． 如果样品的酶活性过低，可以增加孵育时间至72小时

13． 样品的酶活性吸光值在0.1至1.2 OD单位为理想状态，其酶活性与吸光值成线性正相关；吸光值在0.3至0.9 OD单位为状态

14． 反应终止后，即刻进行比色测定

15． 比色测定后，比色皿须清洗

16． 酶活性单位浓度定义：在37℃温度下，每单位酶在单位时间内（每分钟）水解1微摩尔的氯苯胺红 -β-D- 吡喃半乳糖苷

17． 本公司提供系列β-半乳糖苷酶检测试剂产品