逆转录酶活性PERT荧光定量PCR 检测试剂盒产品说明书

主要用途

逆转录酶（reverse transcriptase）活性PERT荧光(SYBR GREEN)定量PCR检测试剂是一种旨在运用SYBR绿色荧光染料作为标记信号，结合产物增强型逆转录酶（PERT）的PCR扩增，既方便、快速，又实时检测和定量分析扩增产物，即逆转录酶酶活性的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。广泛应用于临床病毒感染、生物制品，例如疫苗等病毒污染的监测。产品即到即用，性能稳定，无核酶污染，操作便捷，敏感高效，定量准确，重复性强。

保存方式

保存在－20℃冰箱里，避免反复冻融；染色液（Reagent F）避免光照，有效保证6月

用户自备

1.5毫升离心管：用于样品操作的容器

4℃微型台式离心机：用于样品操作

PCR管：用于样品扩增操作的容器

荧光定量PCR仪：用于荧光定量PCR反应

实验提示

一、 标准样品制备

1． 准备好7个无菌的1.5毫升离心管，标记为1至7号管

2． 按下表分别加入18微升的稀释液（Reagent I）到2至7管

3． 移取5微升标准液（Reagent H）到1号管

4． 小心移取2微升1号管的标准液（Reagent H）到2号管，混匀

5． 小心移取2微升2号管稀释的标准液（Reagent H）到3号管，混匀

6． 小心移取2微升3号管稀释的标准液（Reagent H）到4号管，混匀

7． 以此类推

8． 将1至7号管放进冰槽里备用；标准管浓度见下表

一、 定量检测

1． 移取2微升引导液（Reagent A）到0.5毫升PCR管

2． 加入2微升底物液（Reagent B）

3． 加入6微升补充液（Reagent C）

4． 放进4℃微型台式离心机瞬时离心5秒

5． 在70℃温度下孵育3分钟

6． 冰上预冷

7． 加入13微升转录液（Reagent D）

8． 加入2微升上述制备的标准液（Reagent H）或待测样品（注意：选择4个标准品+空对照）

9． 总量25微升

10． 放进4℃微型台式离心机瞬时离心5秒

11． 在42℃温度下孵育30分钟

12． 在95℃温度下孵育5分钟

13． 置于冰槽里备用

14． 移取15微升反应液（Reagent E）到0.5毫升PCR管

15． 加入2微升上述冰槽里备用的转录产物

16． 加入2.5微升染色液（Reagent F）

17． 加入5.5微升补充液（Reagent D）到总量25微升

18． 使用1000微升枪头加入1滴封隔液（Reagent G）（注意：参见注意事项10）

19． 即刻放进荧光定量PCR仪

20． 荧光定量PCR反应程序为（选择FAM染料）：

注意事项

1． 本产品为20次PCR反应

2． 本产品检测敏感度达10^-8单位/微升

3． 操作时，须戴手套

4． 本产品适合各种荧光定量PCR仪

5． 建议整个操作在4℃下进行

6． 必须使用带滤芯的枪头

7． 所有器皿、离心管、液体等无RNA酶污染

8． 使用时，避免污染母液

9． 用户根据实际情况，选择4至5管标准区间范围

10． 根据用户PCR仪的性能，决定是否加入封隔液（Reagent G）

11． 配制完成后，即刻进行扩增反应，以确保反应物的活性

12． 试剂避免反复冻融

13． PCR扩增反应的最初3个循环为定量基线；3至15个循环的荧光信号的10倍值为荧光阈值；荧光信号达到阈值所需的循环数为Ct值；建议使用Log ΔRn相对定量参数（参考图像如下）：

1． 通常10³至10⁴皮单位（pU）逆转录酶等于1至10个病毒粒子（virion）

2． 通常10³皮单位（pU）逆转录酶等于70至80逆转录酶分子

3． 本公司提供系列逆转录酶活性检测试剂产品