细菌甲羟戊酸激酶活性酶连续循环光谱法定量检测试剂盒产品说明书（中文版）

主要用途

细菌甲羟戊酸激酶（mevalonate kinase）活性酶连续循环光谱法定量检测试剂是一种旨在通过底物甲羟戊酸受到甲羟戊酸激酶磷酸化后，进而由丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶连续循环法反应系统，测定产生ADP过程中，伴随的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的氧化反应， 即采用光谱法测定其氧化后峰值（NADH浓度）的变化，以分析样品中甲羟戊酸激酶活性的经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种细菌，尤其是革兰氏阳性菌样品的甲羟戊酸激酶活性检测。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，高度敏感。

保存方式

保存在－20℃冰箱里，避免反复冻融；有效保证6月

用户自备

1.5毫升离心管：用于样品保存的容器

15毫升锥形离心管：用于样品处理的容器

比色皿或96孔板：用于光谱分析操作的容器

（微型）台式离心机：用于样品预处理

分光光度仪或酶标仪：用于样品光谱分析

实验步骤

一、 待测样品准备

1． 准备好10毫升待测的细菌放进37℃摇床孵育16小时，速度为220RPM

2． 直至OD600＝0.4至0.8，即1至2 X 10⁷细胞/毫升

3． 置于冰槽里5分钟

4． 放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为1000g

5． 小心抽去上清液

6． 加入xx微升裂解液（Reagent A），充分混匀

7． 转移到预冷的1.5毫升离心管

8． 加入xx微升活性液（Reagent B）

9． 强力涡旋震荡15秒

10． 置于冰槽里15分钟，期间每隔5分钟强力涡旋震荡15秒

11． 放进4℃微型台式离心机离心15分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）

12． 小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管

13． 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 BCA蛋白质浓度定量试剂盒－GMS30031.1）

14． 即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操 

二、 测定准备

1． 准备好待测样品（例如细菌裂解悬液等），置于冰槽里 

2． 设定好分光光度仪（温度为30℃）：波长为340nm，间隔2分钟，读数6次（共10分钟），并置零

3． 缓冲液（Reagent C）室温下均衡温度

三、 背景对照测定

1． 移取xx微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入xx微升酶促液（Reagent D）

3． 加入xx微升反应液（Reagent E）

4． 加入xx微升底物液（Reagent F）

5． 放进30℃培养箱里静置3分钟

6． 加入xx微升阴性液（Reagent G）

7． 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）

8． 即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照：340波长读数0分钟 －340波长读数10分钟

四、 样品测定

1． 移取xx微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入xx微升酶促液（Reagent D）

3． 加入xx微升反应液（Reagent E）

4． 加入xx微升底物液（Reagent F）

5． 放进30℃培养箱里静置3分钟

6． 加入10微升待测样品（注意：50微克细菌裂解蛋白；样品须溶解）

7． 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）

8． 即刻放进分光光度仪检测，此为样品活性读数：340波长读数0分钟 －340波长读数10分钟

五、 计算样品活性

六、 酶标仪测定

1． 在96孔板上做好相应标记：背景对照和样品

2． 分别移取xx微升缓冲液（Reagent C）到96孔板里

3． 分别加入xx微升酶促液（Reagent D）

4． 分别加入x微升反应液（Reagent E）

5． 分别加入xx微升底物液（Reagent F）

6． 轻轻摇动96孔板

7． 在30℃温度下孵育3分钟

8． 分别加入xx微升阴性液（Reagent G）或待测样品（50微克细菌裂解悬液蛋白）到相应孔里（注意：样品须清澈）

9． 轻轻摇动96孔板

10． 即刻放进酶标仪检测：0分钟读数和10分钟读数

11． 活性计算：