组织SRC激酶活性光谱法定量检测试剂盒产品说明书

主要用途

    组织SRC激酶活性光谱法定量检测试剂是一种旨在通过多肽底物受到SRC磷酸化后，进而由丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶连续循环法反应系统，测定产生ADP过程中，伴随的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的氧化反应， 即采用光谱法测定其氧化后峰值的变化，以分析组织裂解样品中SRC活性的经典的技术方法。该技术由大师级科学家精心研制、成功实验证明的。其适用于各种组织裂解萃取液样品（动物、人体）、部分或*纯化酶样品中SRC激酶的定量检测，以及抑制剂和激活剂的筛选。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，高度敏感。

实验步骤

一、 待测样品准备

1． 手术取出动物组织，并秤重500毫克组织重量 

2． （选择步骤）放进预冷的15毫升锥形离心管

3． （选择步骤）加入XX毫升清理液（Reagent A）清洗

4． （选择步骤）抽去清理液

5． 移入到一个液氮冻存管

6． 即刻放进液氮罐过夜

7． 次日从液氮罐里取出，即刻（最快速度）用研磨棒碾碎组织成粉末状（注意：切莫使组织冻融）

8． 放进一个15毫升锥形离心管

9． 加入置于冰槽里的XX微升裂解液（Reagent B） 

10． 强力涡旋震荡30秒，充分混匀

11． 放进冰槽里孵育30分钟，期间每10分钟强力涡旋震荡30秒（注意：如需暂时停止，放进－70℃冰箱里储存备用）

12． 即刻放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为10000g

13． 小心移取上清液到新的无菌的1.5毫升离心管

14． 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－GMS30030.1）

15． 即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作

二、 测定准备

1． 准备好待测样品（例如组织裂解悬液等），置于冰槽里 

2． 设定好分光光度仪（温度为30℃）：波长为340nm，间隔1分钟，读数6次（共5分钟），并置零

3． 缓冲液（Reagent C）置于室温下均衡温度

三、 背景对照测定

1． 移取XX微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入XX微升酶促液（Reagent D）

3． 加入XX微升反应液（Reagent E）

4． 加入XX微升底物液（Reagent F）

5． 放进30℃培养箱里静置3分钟

6． 加入XX微升阴性液（Reagent G）

7． 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）

8． 即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照：340波长读数0分钟 －340波长读数5分钟

四、 样品测定

1． 移取XX微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入XX微升酶促液（Reagent D）

3． 加入XX微升反应液（Reagent E）

4． 加入XX微升底物液（Reagent F）

5． 放进30℃培养箱里静置3分钟

6． 加入5微升待测样品（注意：50微克组织裂解蛋白；样品须溶解）

7． 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）

8． 即刻放进分光光度仪检测，此为样品总活性读数：340波长读数0分钟 －340波长读数5分钟

五、 计算样品活性 单位＝微摩尔NADH/分钟

六、 酶标板测定

1． 在96孔酶标板上做好相应标记：背景对照和样品

2． 分别移取XX微升缓冲液（Reagent C）到96孔板中

3． 分别加入XX微升酶促液（Reagent D）

4． 分别加入XX微升反应液（Reagent E）

5． 分别加入XX微升底物液（Reagent F）

6． 轻轻摇动96孔酶标板

7． 在30℃温度下孵育3分钟

8． 分别加入XX微升阴性液（Reagent G）或待测样品（50微克组织裂解悬液蛋白）到相应孔中（注意：样品须清澈）

9． 轻轻摇动酶标板

10． 即刻放进酶标仪检测：0分钟读数和5分钟读数

11． 活性计算：

注意事项

1． 本产品为25次操作，包括背景操作

2． 操作时，须戴手套

3． 系统操作过程中，背景测定只需1次

4． 样品处理忌用磷酸缓冲溶液

5． 样品须澄清，至关重要 

6． 加入样品启动反应后3秒内即刻光谱测定

7． 测定值由高到低变化；测定可持续30分钟

8． 光谱测定后，比色皿须清洗*

9． 样本测定0分钟读数高于5分钟读数表明具有酶活性

10． 建议待测样本蛋白浓度为50微克/5微升（本公司提供  Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－GMS30030.1）

11． 如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度

12． 可以使用SRC抑制剂（4-(4′-Phenoxyanilino)-6,7-dimethoxyquinazoline；IC50=44纳摩尔）作为抑制剂对照或阴性对照

13． Src激酶活性单位浓度定义：在30℃温度下，pH 7.5条件下，每分钟内能够氧化1微摩尔还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）所需的酶量作为一个活性单位

14． 本公司提供系列蛋白激酶检测试剂产品