注意：正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。

微量法 100T/96S

测定意义

维生素 B6（Vitamin B6）又称吡哆素，其包括吡哆醇、吡哆醛及吡哆胺，在体内以磷酸酯的形式存在，是一种水溶性维生素，在细胞中参与多种蛋白质和氨基酸的代谢，对生物体具有极其重要的作用。

测定原理

VB6 与 4-氨基安替比林在强氧化剂作用下生成稳定的黄色化合物，在 390nm 有特征吸收峰。

自备实验用品及仪器

天平、研钵、离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板、恒温水浴锅、蒸

馏水。

试剂组成和配制

提取液：液体 70mL×1 瓶，4℃保存。

试剂一：液体 1mL×1 瓶，4℃保存。试剂二：液体 5mL×1 瓶，4℃保存。

试剂三：液体 8mL×1 瓶，4℃避光保存。试剂四：液体 8mL×1 瓶，4℃避光保存。

样本处理

1. 组织：将样品磨碎，按照质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10  的比例（建议称取约

0.1g，加入 0.6mL 提取液）加入提取液，60℃浸提 30min，加蒸馏水 0.4mL，混匀后于

25℃，16000rpm  离心 10min，取上清测定（动物组织等蛋白含量较高的样本建议离心

20-30 分钟）。

2.    细胞：按照细胞数量（10⁴ 个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1  的比例（建议 500万细胞加入 0.6mL 提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min）；加蒸馏水 0.4mL，混匀后于 25℃，16000rpm 离心 10min，取上清测定。

3. 血清：直接测定。

测定操作

计算公式

a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下

标准曲线：y = 0.3635x+0.0205，R² = 0.9986

• 按照蛋白含量计算

VB6 含量（μg/mg prot）=（△A - 0.0205）÷ 0.3635×V 反总÷（V 样×Cpr）

= 13.76×（△A - 0.0205）÷ Cpr

2.按照样本质量计算

VB6 含量（μg/g）=（△A - 0.0205）÷ 0.3635×V 反总÷（V 样×W÷V 样总）

= 13.76×（△A - 0.0205）÷ W

1. 按照细胞数量计算

VB6 含量（μg/10⁴ cell）=（△A - 0.0205）÷ 0.3635×V 反总÷（V 样×细胞数量÷V 样总）

= 13.76×（△A - 0.0205）÷ 细胞数量

2. 按照液体体积计算

VB6 含量（μg/mL）=（△A - 0.0205）÷ 0.3635×V 反总÷V 样

= 13.76×（△A - 0.0205）

V 反总：反应总体积，0.2mL；：V 样：加入样本体积，0.04mL；V 样总：加入提取液体积，

1mL； Cpr：蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g b．用 96 孔板测定的计算公式如下

标准曲线：y = 0.1818x+0.0205，R² = 0.9986

1. 按照蛋白含量计算

VB6 含量（μg/mg prot）=（△A - 0.0205）÷ 0.1818×V 反总÷（V 样×Cpr）

= 27.52×（△A - 0.0205）÷ Cpr

2. 按照样本质量计算

VB6 含量（μg/g）=（△A - 0.0205）÷ 0.1818 ×V 反总÷（V 样×W÷V 样总）

= 27.52×（△A - 0.0205）÷ W

3. 按照细胞数量计算

VB6 含量（μg/10⁴ cell）=（△A - 0.0205）÷ 0.1818×V 反总÷（V 样×细胞数量÷V 样总）

= 27.52×（△A - 0.0205）÷ 细胞数量

4. 按照液体体积计算

VB6 含量（μg/mL）=（△A - 0.0205）÷ 0.1818×V 反总÷V 样

=27.52×（△A - 0.0205）

V 反总：反应总体积，0.2mL；：V 样：加入样本体积，0.04mL；V 样总：加入提取液体积，

1mL； Cpr：蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g

注意事项

1. 若测定结果中吸光值超过 1，请将样本稀释后进行测定，并在计算公式中乘以稀释倍数。

2. 蛋白浓度较高的样品，比如动物组织，若显色完成后有沉淀产生，将样本稀释后再测定， 在计算公式中乘以稀释倍数。

3. 显色完成后立即进行测定。