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更新时间：2021-03-23
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DNA 在自由基(如·OH)的攻击下容易发生损伤,即脱氧戊糖遭到破环,磷酸二脂键的断裂,碱基的破环或脱落,便可进一步产生单链断裂或双链断裂。将细胞固定于低熔点琼脂糖中,取少量细胞涂在载玻片上,用碱高盐溶液破坏细胞膜,再用碱溶液使 DNA 分子解旋。将载玻片置于电泳液中,在电场的作用下,DNA 分子向阳极移动。如果 DNA 损伤严重,碎片多,则电泳速度快。未受损伤的 DNA 大分子则由于细胞膜的阻隔,滞留在原处。用 PI 染色或银染,可观察到DNA 受损的细胞形同彗星现象,作定性分析。也可用相关的软件作定量分析。
二、所需仪器及自备试剂
低速离心机、水平电泳仪、荧光显微镜、37℃和 45℃恒温水浴箱、载玻片、盖玻片、平皿、微量移液器、1.5ml Microube、0.4mmol/LTris-HCl(pH7.5)缓冲液、PBS
Propidium Iodide(PI)和EB 有毒,操作时要戴手套。
四、操作步骤
1、细胞用冰冷的PBS 洗一次,离心收集,用PBS 重悬使其密度为 1×106 个/mL；
2、铺胶：下述各浓度琼脂糖凝胶均用 PBS 配制
第 1 层凝胶的制备：将载玻片的磨砂面向上,45℃预热,将预热 45℃的 100μL 的 0.5%正常熔点琼脂糖(NMA)铺于载玻片上,盖上干净的盖玻片,再置 4℃下 10min 使NMA 凝固。
第 2 层凝胶的制备：将 10μL 细胞(约 104 个)和 75μL 的 0.7%低溶点琼脂糖LMA(在 37℃下水浴加热至少 20min 使之*溶化)混合均匀。然后,轻轻揭去盖玻片,迅速将含细胞的LMA 滴到第 1 层琼脂糖上, 立即盖上另一干净盖玻片,置 4℃ 10min 使第 2 层LMA 凝固。
第 3 层凝胶的制备：第 2 层LMA 凝固后,在室温下小心移去盖玻片,滴加预热 37℃的 75μL 的 0.7%低溶点琼脂糖LMA,如上盖上盖玻片 4℃下凝固(第三层覆盖第二层周围 0.5mm,增加凝胶化作用时间至 30min, 高湿度环境)。
3、细胞裂解
移去盖玻片,将玻片置于平皿中,倒入预冷的 Lysis Bufffer(使用前每 9mL 加入 1mL 的DMSO),4℃ 裂解 1～2h,取出载玻片用PBS 漂洗。
将载玻片置于水平电泳槽。倒入新配制的碱性电泳缓冲液(用户自备 1mmol/L EDTA,300mmol/L NaOH),约覆过载玻片胶面 0.25cm 左右,室温放置 20～60min,以便使DNA 在碱性条件下解螺旋和产生碱易变性区段,使DNA 断链在电场中易于迁移。
在电压 25V,电泳 20～30min,电压、电流可用改变缓冲液面高低来调节。6、中和与染色
电泳后将载玻片置于平皿内。加入 0.4mmol/L Tris-HCl(ph7.5)缓冲液,将载玻片没入,4℃中和三次,每次 10min,弃去 Tris-HCl 缓冲液,每载玻片加 20μL 的 PI 染液或 EB 染液,盖上盖玻片,避光染色10min。
荧光显微镜 515～560nm 波长的激发光、PI 染色的DNA 图象呈红色,EB 染色的DNA 图象呈桔红色, 可清楚地观察到核DNA 和迁移的DNA(即慧星尾)。每个样本随机选择 100 个细胞,测定核DNA 直径和DNA 迁移的长度,可并用相应的软件分析。
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