冰冻切片皮尔斯（PERLS-DAB）非血红素铁（三价）强化染色试剂盒

主要用途

    冰冻切片皮尔斯（PERLS-DAB）非血红素铁（三价）强化染色试剂是一种旨在使用氰亚铁酸盐结合反应技术，进一步使用二氨基联苯胺的强化扩增，分析冰冻组织切片中三价正铁离子（ferric ion）沉积现象的经典的技术方法。该技术经过精心改良皮尔斯（Perls）方法、成功实验证明的。主要适用于冰冻组织切片的三价正铁离子检测。广泛用于动物中枢神经组织等病理生理的研究。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，显色清晰。

技术背景

        三价铁（ferric）是氧化数为三的铁。通过无机矿物酸（mineral acid）水解，三价铁从蛋白结合形态中释放出来。三价铁具有难溶性的特点。通常三价铁先被还原使之与有机配位体分离，分离出来的二价铁被生物体吸收。动物和人体的整个消化道都可以吸收，植物在根尖处吸收。机体大约有三分之二的铁存在于红细胞的血红蛋白和肌肉的肌红蛋白中，20％的铁以不同形式存在于肝、脾和其他组织中。铁作为氧的载体，保证组织内氧的正常输送，在细胞生物氧化和能量代谢过程中发挥着重要作用。正常脾组织和骨髓里含有少量的三价铁。组织中过量存在三价铁，可能与血色病（hemochromatosis）和含铁血黄素沉着症（hemosiderosis）有关。由于中枢神经组织中小胶质细胞（microglia）、少突胶质细胞（oligodendroglia）和神经元（neurons）以及非神经组织含有非血红素性三价铁的轻度沉积，使用常规的皮尔斯（PERLS）方法敏感性不足，采用二氨基联苯胺（3,3’-diaminobenzidine，DAB）的强化扩增效应，分析三价铁沉积现象。通过酸性氰亚铁酸盐（ferrocyanide）与组织中三价正铁离子（ferric ion）结合，成为亚铁氰化铁（ferric ferrocyanide），进而催化二氨基联苯胺的氧化，电子供体DAB失去电子，而呈现出颜色变化和沉积，形成棕褐色不溶性产物。其反应原理如下：

产品内容

清理液（Reagent A）  毫升

固着液（Reagent B）  毫升

染色液（Reagent C）  毫升

酸性液（Reagent D）  毫升

封阻液（Reagent E）  毫升

显色液（Reagent F）  瓶

稀释液（Reagent G）  毫升

反应液（Reagent H）  毫升

产品说明书  1份

保存方式

保存显色液（Reagent F）在-20℃冰箱里；其余的保存在4℃冰箱里；染色液（Reagent C）和显色液（Reagent F），避免光照；染色液（Reagent C）和酸性液（Reagent D）具有腐蚀性和毒性，注意操作安全；有效保证6月

用户自备

2毫升离心管：用于工作液配制的容器

小型染色缸：用于石蜡切片的去石蜡和染色操作

光学显微镜：用于组织细胞染色后观察分析

实验步骤

• 样本固着处理
• 取出待测的5微米厚的冰冻切片  
• 小心加上xx微升清理液（Reagent A）在切片上，铺满整个样品表面
• 小心移去切片上的清理液（Reagent A）
• 小心加上xx微升固着液（Reagent B），铺满整个样品表面
• 室温下，孵育10分钟
• 小心移去切片上的固着液（Reagent B）
• 小心加上xx微升清理液（Reagent A），清洗样品表面
• 小心移去切片上的清理液（Reagent A）
• 重复实验步骤7至8一次
• 样本染色处理

操作开始前，将4℃冰箱里的试剂盒中的染色液（Reagent C）和酸性液（Reagent D）置入室温下，分别移出1毫升到2.2毫升离心管，混匀后，标记为染色工作液，用锡箔纸包裹，避免光照。然后进行下列操作。

• 小心加上xx微升染色工作液，铺满整个切片样品表面
• 室温下孵育30分钟；或直至可见篮色
• 小心移去切片上的染色工作液 
• 室温下，小心将切片置入xx毫升清理液（Reagent A）中孵育2分钟
• 小心移去切片上的清理液（Reagent A） 

三、 样本显色处理

实验开始前，将－20℃冰箱里试剂盒中的显色液（Reagent F）取出，加入xx毫升稀释液（Reagent G），混匀，置入冰槽里；然后移取xx微升配制后的显色液（Reagent F）和xx毫升反应液（Reagent H）到2.2毫升离心管，充分混匀，标记为显色工作液，避免光照。  

• 小心加上xx微升封阻液（Reagent E）在切片上，铺满整个切片样品表面
• 室温下孵育20分钟
• 小心移去切片上的封阻液（Reagent E）
• 室温下，小心将切片置入xx毫升清理液（Reagent A）中孵育2分钟
• 小心移去切片上的清理液（Reagent A）（注意：须清洗干净，否则影响下一步操作）
• 小心加上xx微升配制后的显色液（Reagent F）在切片上，铺满整个切片样品表面
• 室温下孵育20分钟，避免光照
• 小心移去切片上的显色液（Reagent F）
• 小心加上xx微升显色工作液在切片上，铺满整个切片样品表面
• 室温下孵育15分钟，或直至肉眼可见棕黑色沉积，避免光照
• 小心移去切片上的显色工作液 
• 室温下，小心将切片置入xx毫升清理液（Reagent A）中孵育2分钟
• 小心移去切片上的清理液（Reagent A）
• 放上盖玻片或封片
• 即刻在一般光学显微镜下观察：三价铁沉积阳性细胞呈现棕褐色 

注意事项

• 本产品为50次操作
• 操作时，须戴手套和防护面罩
• 建议在通风柜里操作
• 所有操作在室温下进行
• 染色液（Reagent C）和酸性液（Reagent D）具有腐蚀性和毒性，注意操作安全
• 每次更换试剂溶液时，保持切片面基本晾干。空气中晾干状态为没有水滴，呈湿润状态，可见反光
• 试剂溶液在切片表面时，避免有气泡存在，同时确保铺满切片表面
• 样品染色避免过度，肉眼可见棕色即可终止染色
• 配制后的显色液（Reagent F）避免反复冻融
• 显色工作液不能储存后使用；如果发现沉淀，不宜使用
• 组织细胞染色完成后，即刻进行光学显微镜观察 
• 本公司提供系列组织细胞金属元素染色试剂产品

质量标准

• 本产品经鉴定性能稳定
• 本产品经鉴定显色清晰